永生上皮細胞

冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗操作步驟：  公司產(chǎn)品僅用于科研，不得用于臨床．
a．采用認可的方案處死嚙齒動物。    
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。  
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

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實驗材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個； 
3、50ml離心筒2個 
4、滅菌培養(yǎng)皿1個，細胞培養(yǎng)瓶1個 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 
6、細胞計數(shù)板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺；
細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學的條件，可以根據(jù)實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學、原位雜交、同位素標記等各種儀器設(shè)備 
記錄方式可采用攝影照片、縮時電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應(yīng)用的學科領(lǐng)域較為寬廣，如細胞學、免疫學、腫瘤學、生物化學、遺傳學、分子生物學等；
適用的對象范圍廣，從低等動物到高等動物，一種動物的不同年齡階段以及不同組織，都可進行有針對性的研究。
6.研究的費用相對較經(jīng)濟
可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學性狀相似的實驗對象。

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細胞凍存：
對培養(yǎng)的細胞進行凍存的最佳方法是將細胞置于含有(DMSO)等冷凍保護劑的*培養(yǎng)基中于液氮中儲存。冷凍保護劑可降低培養(yǎng)基的冰點，并可減緩冷卻速度嗎，大大降低冰晶形成的危險  (冰晶可損傷細胞，導(dǎo)致細胞死亡)。
注：DMSO 可促進有機分子進入組織。操作含DMSO的試劑時，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。 
細胞凍存指導(dǎo)原則
凍存細胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。與其他細胞培養(yǎng)操作一樣，我們建議您嚴格遵守您所用細胞系附帶的操作說明，以便獲得最佳結(jié)果。 
1）在高細胞濃度情況下進行培養(yǎng)細胞的凍存，并且細胞傳代次數(shù)盡可能少。確保凍存前活細胞百分比至少為90%。請注意最佳凍存條件取決于所用細胞系。 
2）細胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器使溫度每分鐘大約降低1°C。
3）必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑
4）將冷凍的細胞于 -70°C 以下溫度儲存；溫度高于 -50°C 時，冷凍的細胞將開始變質(zhì)。 
5）必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細胞。裝有冷凍細胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存 
6）必須穿戴個人防護設(shè)備。 
7）所有與細胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風櫥內(nèi)進行。
人頸上皮細胞*培養(yǎng)基 100mL4-硝基本-N-乙酰-β-D-基葡萄糖苷，英文名或英文縮寫：PNP-Nag，級別：超，80%，規(guī)格：1公斤

Yac-1細胞，小鼠瘤細胞 PA317(成纖維細胞) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞;HUV-EC-C3,4-二拂本晴, 98% 3,4-Difluorobqnzonitnilq 6448-6-0

CXCL12 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 CXCL12 / SDF-1 蛋白 (Fc 標簽)NZMBROTHNZM 肉湯, 粉末生物技術(shù)級粉末RT不sigma

Saos-2(人骨肉瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 人 Ephrin-A4 / EFNA4 人細胞裂解液 (陽性對照) 2-Acetylpyridine甲基-2-基酮500克CP，99%

CSC, 小鼠心肌細胞本;基本;本基聯(lián)pxenylhydr
CST7 Others Human 人 Cystatin-F / CST7 / Cystatin-7 人細胞裂解液 (陽性對照) 帕米1酸二鈉Pamidronate Di質(zhì)量規(guī)格：>99%,五水合物

人支氣管上皮細胞總RNAHBEpiC NA帕米1酸二鈉（標準品）Pamidronate Di質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標準品

ELK1 Others Human 人 ELK1 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 硫酸慶大霉素Gentamicin sulfate 質(zhì)量規(guī)格：>590IU/MG,BR

中國倉鼠卵巢細胞(亞系克隆);CHO-HCV-E1硫酸慶大霉素(標準品)Gentamicin sulfate 質(zhì)量規(guī)格：含量測定

QGY-7701細胞，肝癌細胞 人上皮細胞癌,Ski細胞 KM小鼠子瘤株;U27頭孢呋辛鈉Cefuroxime  質(zhì)量規(guī)格：>855ug/MG,USP30
永生上皮細胞人腦瘤細胞;SF17 大鼠肝竇內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基 100mL2,4-二氯喹唑啉2,4-Dichloroquinazoline質(zhì)量規(guī)格：>98%

肝動脈內(nèi)皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)9-氯甲基蒽9-(Chloromethyl)anthracene質(zhì)量規(guī)格：>98%，進口原裝

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/barnswallow/HongKong/D10-1161/2010) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 1-溴蒽(>97.0%(GC))1-Bromoanthracene質(zhì)量規(guī)格：>97.0%(GC)

人結(jié)直腸腺癌細胞;COLO 2052-溴蒽(>97.0%(GC))2-Bromoanthracene質(zhì)量規(guī)格：>97.0%(GC)

豚鼠肺細胞;GP-F1 狗腎細胞，MDCK細胞 NG108-15細胞，小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞與大鼠膠質(zhì)瘤細胞之融合細胞9,10-雙(二乙基膦甲基)蒽(>98.0%(GC))9,10-Bis(diethylphosphonomethyl)anthracene質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC)
實驗操作：
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。
3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除血管外部的洗滌液澄清，用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。
4、除去內(nèi)皮細胞：將血管縱向剪開， 內(nèi)膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復(fù)刮動內(nèi)膜層4-5遍，去掉內(nèi)皮細胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。
5、分離中膜：將去掉內(nèi)膜的血管，繼續(xù)刮動分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。
6、消化：在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)；余下的組織繼續(xù)加入消化液，消化15min ，重復(fù)消化3次。
8、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。
9、培養(yǎng)細胞密度：調(diào)整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
10、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。